13万个注释神经元，5300万个突触，普林斯顿大学等发布首个完整「成年果蝇」大脑连接组

从秀丽隐杆线虫 (302 个神经元) 到果蝇 (约 10 万个神经元)，截止到今天，已经有许多项目绘制了各种生物的全脑连接组图谱。而黑腹果蝇是被人类研究得最彻底的生物之一，截至 2017 年，已有 8 个诺贝尔奖颁发给使用果蝇的研究。

研究者对果蝇的研究还在继续，近日，来自普林斯顿大学等机构的研究者发布了果蝇的全脑连接组，包括约 130k 个注释神经元和数千万个类型突触。

大家多少都了解，从古老的动物开始就存在基本的神经系统，但大脑系统的出现要追溯到 5 亿年前。研究表明将大脑划分为不同区域有助于理解其功能。

然而，多年来，关于神经元和突触层面的神经连接图一直存在争议，造成这一现象的主要原因在于人类缺乏能够重构此类连接图的技术。随着技术的发展，情况在 21 世纪初才开始发生变化。

直到今天，来自普林斯顿大学等机构的研究者发布了果蝇的全脑连接组，这是首个完整的成年果蝇大脑神经连接图。

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论文地址：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.27.546656v1.full.pdf

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在该成果发布之后，有人表示：「许多项目绘制了各种生物的全脑连接组图，从秀丽线虫（302 个神经元）到果蝇（约 100k 神经元）。以我们目前的计算能力，为什么不能在一个虚拟的 3D 环境中对这些生物进行精确的计算机模拟呢？」

首个完整的成年果蝇大脑神经连接图

果蝇的大脑看起来很小，拥有 10^5 个神经元和 10^8 个突触，尽管如此，果蝇借助这些能够完成看、闻、听、走，当然还能飞。

长期以来，研究者通过电子显微镜（EM）图像已经对果蝇大脑的部分区域进行了重建，这些图像清晰度还不错，能够显示出神经元的细小分支和相连的突触。由此得到的神经回路的连接图为研究者理解大脑如何产生社交行为、与记忆有关的行为以及导航行为提供了关键见解。

然而，EM 方法虽然已经应用于大脑的部分区域，并重建了信息丰富的局部连接图，但对于更全面地理解大脑功能来说，这种方法还不足够。

此前，研究者基于 Ito 等人的研究来构建单个神经突触网格，本文采用的网格是基于此前生成完整大脑分割的 JFRC2 标准脑模板，这些网格也被用于 Virtual Fly Brain（模拟果蝇）项目。通过一系列非刚性变换，该研究将这些网格从 JFRC2 空间移动到 FlyWire（FAFB14.1）空间中。

注：FlyWire 是一个用于探索果蝇大脑的全脑连接组学平台。自 2019 年以来，科学家和经验丰富的校对员一直在使用 FlyWire 来校对 AI 对整个果蝇大脑的分割。截至 2023 年 6 月，在 FlyWire 中已经校对了超过 120,000 个神经元，包括整个中央大脑。

如下图所示，该研究重建的整个成年果蝇大脑包含 127,978 个神经元（图 1a），它们之间有 5300 万个突触。成年雌性果蝇的全脑图像 (图 1e, f) 先前通过串行切片传输 EM 获得，并由 Zheng et al. 发布到公共领域。

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本文表明，该研究对整个果蝇大脑的重建所得到的连接图已经足够完整，足以被称为「连接组（connectome）」。与秀丽隐杆线虫（300 个神经元，小于 10^4 个突触）和果蝇第一龄幼虫（3,000 个神经元，5×10^5 个突触）相比，其连接组有了明显的飞跃：连接组不仅仅是数量上超越了果蝇半个大脑，它还涵盖了果蝇中央大脑的食道下区（SEZ），该区域对味觉和机械感知等非常重要，此外，连接组还涵盖了从果蝇大脑向下驱动运动神经元的过程。

下图为神经元类别，图（a）显示将果蝇大脑中的神经元按「流」进行分类：内在的、传入的、传出的。然后每个流类根据位置和功能进一步划分为「超类」。第一次公开发布的复眼缺失了约 8000 个视网膜细胞和一个半球的四个小眼珠，这些部分用阴影条表示。（b）利用这些神经元注释，该研究在果蝇大脑的超类之间创建了一个聚合的突触图。(c) 每个超类中所有神经元的效果图。(d) 除了眼神经和颈结缔组织 (CV) 外，每个半球还有 8 个神经。所有穿过神经的神经元都被重建和解释了。(e) 感觉神经元可以根据其对感觉模态的响应进行细分。在 FlyWire 中，几乎所有的感觉神经元都已经按模态进行了分类。(f) 所有非视觉感觉神经元的渲染图。

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下图为果蝇大脑负责处理视觉信息的示图：

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下图为信息通过果蝇的中央大脑流动：

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有史以来最大的细胞类型的验证集合

FlyWire 连接组是迄今为止获得的最大和最复杂的连接组。在另外一篇论文《A consensus cell type atlas from multiple connectomes reveals principles of circuit stereotypy and variation》中，团队提出并回答了一些关键问题，进一步解释了这种规模的连接组：

1）如何知道哪些 edge 是重要的？

2）如何简化连接组图以帮助自动或人工分析？

3）该连接组在多大程度上是一个单一的大脑的快照或代表这个物种的整体？

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论文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.27.546055v1.full.pdf

这些问题，都与数据集内和跨数据集的连接组注释和细胞类型鉴定有着密不可分的联系。

在最基本的层面上，如果没有一个全面的注释系统，导航这个连接组将是非常具有挑战性的。所以，团队这篇论文的注释提供了一个索引和分层的人类可读部件列表，使生物学家们能够探索他们感兴趣的系统和神经元。

连接组注释对于确保数据质量也是至关重要的，因为它不可避免地揭示了必须纠正的分割错误。此外，果蝇有丰富的历史，探究广泛的先天和后天行为的电路基础，以及它们的发育遗传起源；想要实现数据集的全部潜力，只有通过交叉识别连接组内的细胞类型与那些先前在已发表和正在进行的文献中的特征。

与部分半脑连接组的对比证实了，大多数苍蝇细胞类型是高度定型的；以及，定义简单和一般启发式的连接组内的连接是可靠的，也更可能是功能性的。然而，这也揭示了一些细胞类型的意外变化，并表明许多细胞类型最初在半脑中的报告不能可靠地重新识别。这一发现使研究者认为有必要开发和应用一种新的强有力的方法来定义跨连接组学数据集的细胞类型。

在这项研究中，研究者为苍蝇大脑中的所有神经元生成了人类可读的不同粒度水平上（超类、细胞类、血缘类等）的注释。

研究者提供的 4179 种细胞类型图谱并不是有史以来最大的（半脑有 5620 种，小鼠脑中的最新工作提供了多达 5000 个分子簇）。然而，某种程度上说，它是有史以来最大的细胞类型的验证集合。

细胞类型是一个关于动物内部和跨动物的生物变异性的可证实的假设。在秀丽隐杆线虫中，从最初的连接组推断出的 118 个细胞类型已被随后的连接组和分子数据的分析所明确支持。在一些哺乳动物中，生成 100 个细胞类型的目录是可能的，且已被比如在视网膜或运动皮层的多模态数据所验证。

然而，大规模的分子图谱产生了高信息量的层次结构，但还没有尝试精确地定义终端细胞类型 —— 跨个体的最细单元。研究者首次对 5000 多种细胞类型测试了这一可证伪的细胞类型假设，在 3 个半球的连接体数据中确认或纠正了约 3166 种细胞类型。

值得注意的是，连接组数据对细胞类型的划分特别有意义：它本身是多模态的（通过提供形态学和连接性），而且能够看到大脑内的所有细胞（完整性）。通过这一严格测试的细胞类型是非常不可能被修改的（永久性）。基于这种理解，仅在 FlyWire 数据集的两个半球内定义的另外 850 个细胞类型也应该是准确和永久的。研究者认为，连接组数据将成为细胞类型的黄金标准。因此，将分子和连接组学的细胞类型联系起来将是关键。

在 FlyWire 中，超过三分之一的半脑细胞类型还不能被识别，可能人们会感到有些惊讶甚至失望。研究者重申，大多数细胞是可以被识别的，而且他们期望通过自己和其他同行的努力，在现在的平台和工具上继续逐步改进。

尽管如此，目前的结果揭示了几个重要的问题：首先，使用单一脑半球的数据所确定的许多细胞类型现在需要修改；其次，新的多连接组分型方法（图 6）为该问题提供了一个强大而有效的方法；第三，成年苍蝇连续变异的例子通常与哺乳动物细胞类型相关，研究者现在也有工具和数据，能够以此前不可能的精度来处理这种变异。

跨脑细胞分型

总体来说，这项工作奠定了某些基础，既可以深入研究目前和预期中正常的苍蝇连接组，也可助力未来的性双态、经验依赖的可塑性、全脑规模发展和疾病等方向的研究。

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