Was sind die Prinzipien und Anwendungen von rtPCR?

Das Prinzip ist: Gesamt-RNA aus Geweben oder Zellen extrahieren, die darin enthaltene mRNA als Vorlage verwenden und Oligo (dT) oder Zufallsprimer verwenden, um Transkriptase in cDNA umzuwandeln. Verwenden Sie dann cDNA als Vorlage für die PCR-Amplifikation, um das Zielgen zu erhalten oder die Genexpression nachzuweisen.

Diese Technologie wird hauptsächlich verwendet, um Gentranskriptionsprodukte zu analysieren, Zielgene zu erhalten, cDNA-Sonden zu synthetisieren und effiziente RNA-Transkriptionssysteme zu konstruieren.

RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) ist eine Technologie, die RNA Reverse Transkription (RT) und cDNA Polymerase Chain Amplification (PCR) kombiniert.

Zuerst wird cDNA aus RNA durch die Wirkung der Reverse Transkriptase synthetisiert, und dann wird die cDNA als Vorlage für die Amplifikation und Synthese des Zielfragments verwendet. Die RT-PCR-Technologie ist empfindlich und vielseitig und kann zum Nachweis des Genexpressionsniveaus in Zellen, des Gehalts an RNA-Viren in Zellen und zur direkten Klonierung von cDNA-Sequenzen spezifischer Gene eingesetzt werden.

Die als Vorlage verwendete RNA kann Gesamt-RNA, mRNA oder ein in vitro transkribiertes RNA-Produkt sein. Unabhängig von der Art der verwendeten RNA muss sichergestellt werden, dass die RNA frei von RNase- und genomischer DNA-Kontamination ist.

Die für die Reverse Transkription verwendeten Primer können je nach den spezifischen Bedingungen des Experiments aus Zufallsprimern, Oligo dT und genspezifischen Primern ausgewählt werden. Für kurze mRNAs eukaryotischer Zellen, die keine Haarnadelstruktur aufweisen, stehen alle drei zur Verfügung.

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